嘉靖年間，明朝書院的發展達到另一個高峰。同一時期，明朝書院也先後面臨了政府的四次禁毀行動。前面兩次的禁毀書院行動，發生在明世宗在位期間(年號為嘉靖)。第一次禁毀書院的時間為嘉靖十六年(1537年)，當年二月，御史游居敬上疏給皇帝，內容談到南京吏部尚書湛若水私創書院，廣收無賴之徒，目的是提倡個人的邪說。為了端正人心，所以朝廷下令罷廢各地私創書院。第二次是在嘉靖十七年(1538年)四月，吏部尚書許讚向皇帝上奏，提及各地官員廣建書院，會造成混亂，應立即拆毀書院。面對政府兩次的禁毀行動，書院發展會因此而衰落嗎？答案顯然是否定的，如同明人沈德符於《萬曆野獲編》一書裡所說的那樣，「雖世宗力禁，而終不能止。」第三次禁毀書院的時間是在萬曆七年(1579年)，由明代著名的改革家張居正所發起。張居正為何要禁毀書院？這和他對心學教育的不滿有關。他認為心學在書院的講學，乃是別立門戶，「空談廢業」，影響視聽，必會開啟士人之間請託的風氣。於是他著手進行禁毀書院的行動，令各省書院改為政府公廨。和嘉靖時期相比，這次的禁毀行動規模較大，措施較嚴，所以不少書院的確遭到毀廢。例如紹興的五雲書院、貴溪的玉溪書院、成都府大益書院、太原河汾書院、宣化縣敷文書院等均遭毀壞。話雖如此，仍有不少書院可以避開此次浩劫。某些書院在地方官員的努力下，或得以保存，或部分損壞；某些書院則用改變名稱的方式，避開此禍，例如貴溪縣象山書院便改名為象山祠、安福縣復古書院則改名為三賢祠；某些書院因為地處偏僻，所以未遭逢大難，如饒陽縣近聖書院。根據《明通鑑》一書的記載，張居正這次禁毀書院的行動中，總共有六十四處的書院遭到毀壞。這次的禁毀行動，直到張居正去世後，書院才陸續恢復。第四次發生在天啟五年(1625年)。這次禁毀行動，和東林書院有關，也就是明代著名的東林黨爭。這是以顧憲成、高攀龍為首的東林黨，以及以魏忠賢為首的閹黨，兩派黨人之間在明朝政治上的政治紛爭。這一部分，將在「書院與明末黨爭」此一單元進行詳細說明。這次禁毀書院行動，是由魏忠賢所下的命令，直到崇禎皇帝即位後，罷除魏忠賢，恢復全國書院。